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EntransterTM-D4000常见问题

1.EntransterTM-D转染的原理是什么?

答:EntransterTM-D转染试剂由纳米高分子聚合物组成,分子内含有许多氨基,在生理pH下会发生质子化,这些质子化的氨基可以中和DNA质粒表面的负电荷,使DNA分子由伸展结构压缩为体积相对较小的DNA粒子,并包裹在其中,使DNA免受核酸酶的降解。转染复合物主要是通过细胞内吞作用将DNA 转移进入细胞,形成内含体(endosome),DNA从内含体释放,进入细胞质中,再进一步进入核内转录、表达。EntransterTM-D转染试剂,无免疫原性,纳米化后颗粒更均匀同时毒性更小。

2.如何获得高效的转染效率?

答:仅就转染试剂EntransterTM-D来说,DNA(μg):转染试剂量(μl)是影响转染效率最大的因素。建议初次使用时,一定先优化DNA(μg):转染试剂量(μl)的比值,确定最优的比值。

3.为什么贵公司不直接给出相关细胞的优化条件,而需要先自己做一个梯度预实验?

答:因为对我们的转染试剂来说,DNA与转染试剂的比例是决定转染效率的最重要因素,恰当的比例可以让转染试剂更好地结合,并形成合适的大小,顺利进入细胞表达。由于DNA的量各个实验室由于具体条件所限,测量值并不完全精确,这种偏差会造成做转染实验时实际比例的偏移。通过预实验可以实际纠正这种偏移,由于每个实验室条件的相对稳定,以后转染实验时,只需按预实验条件执行,即可得到稳定的高效转染实验结果。

4.你们不同DNA(μg):转染试剂量(μl)的差异到底有多大?更详细的优化条件是什么?

答:对转染效率的影响很大,某个梯度转染效率可能只有10%,但另一个梯度的转染效率可能就有60%。更详细优化,以24孔板为例,质粒浓度可以设0.75μg、1μg、1.5μg、2μg、2.5μg、3μg等梯度,同时转染试剂可以设DNA(μg):转染试剂量(μl)为1:1.3、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6几个梯度。

5.其他影响转染的因素还有哪些?

答:首先是细胞的状态,最好选用传代在50代以内,生长旺盛细胞,提前24h再次传代,细胞密度通常在60-70%,但也可根据细胞的生长速度适当调整。质粒的纯度对转染也有影响,最好采用较纯的质粒。

6.为什么铺板的细胞密度(汇合度)对转染效率也有影响?

答:是的。对大多数细胞24小时后分析结果来说,我们推荐提前一天铺板的细胞密度通常在60-70%,但实际上,如果在更长的时间(48小时甚至72小时)分析结果,提前一天铺板的细胞密度可选择30-50%,这时的转染效率将可能会更高更理想。

7.EntransterTM-D对哪些细胞转染效率较好?

答:EntransterTM-D对具体的细胞的转染效率详见英格恩网站。