293全系转染试剂EntransterTM-H，大规模悬浮转染、病毒包装与重组蛋白生产

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18668-04	0.4ml	¥999.00	293全系转染试剂EntransterTM-H，大规模悬浮转染、病毒包装与重组蛋白生产数量	加入购物车

产品介绍

Entranster^TM-H 是其研发的纳米聚合物转染试剂，针对 HEK293 全系优化，细胞毒性可控，覆盖从微孔板到数十升悬浮放大全场景。

本品适合在 HEK293 全系（HEK293、HEK293T、HEK293T-suspension、HEK293F、HEK293-6E、Expi293 等）细胞中进行贴壁转染、大规模悬浮转染、病毒包装（慢病毒、AAV、腺病毒）与重组蛋白生产。既支持贴壁培养也支持悬浮培养。

主要特点

可用于大规模正向转染，也可用于高通量筛选的反向转染

可用于病毒包装，也可以用于重组蛋白转染

既支持贴壁培养也支持悬浮培养。

产品说明书

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应用本产品文献

反向转染（针对HEK293T与高通量筛选）

反向转染指先在培养板内形成DNA-试剂复合物，再加入悬浮细胞悬液，使复合物与细胞同步沉降接触。适用于HEK293T高通量筛选、慢病毒包装快速流程，以及希望省去”提前一天铺板”的实验。

1.实验过程（以6孔板为例）

预备：操作前先用胰酶消化HEK293T细胞，DMEM+10%FBS（无双抗）重悬至5-8×10⁵ cells/ml，置37℃备用。与⑴-⑶复合物制备过程并行进行，避免复合物在空孔内放置超过30分钟。

⑴将5μg的DNA用50μl无血清稀释液（OPTI-MEM或无血清DMEM）稀释，充分混匀（用量同正向，参考表1按容器对应；如做慢病毒包装，5μg为三质粒总量，按转移质粒：psPAX2：pMD2.G=4:3:1分配，参考五节5.病毒包装质粒配比）。

⑵将5μl的Entranster^TM-H用50μl无血清稀释液稀释，混匀，室温静置5分钟。

⑶将Entranster^TM-H稀释液缓慢加入到DNA稀释液中，充分混匀（加样器吹吸8-10次或短暂涡旋3-5秒，避免长时间剧烈振荡），室温静置15-20分钟（不超过25分钟）。转染复合物制备完成。

⑷将全部转染复合物（约100μl）均匀滴加入空培养孔，轻摇使其铺展于孔底。

⑸取预备好的细胞悬液（5-8×10⁵ cells/ml）约1.9ml加入到含复合物的孔中，终体积约2ml，对应每孔1.0-1.5×10⁶ cells。

⑹轻柔前后或左右摇动培养板（不可画圈，否则细胞会向中心聚集），放入培养箱培养。

⑺4-8h后细胞贴壁，可酌情换为新鲜完全培养基；用于慢病毒包装时换为2% FBS收毒培养基（低血清下病毒颗粒更稳定，便于后续浓缩）。常规检测时间同正向转染（24-48h）；慢病毒包装收毒时间按五节4.收获时间。

2.注意事项

⑴反向转染细胞当天接种、当天转染，接种密度需直接达到正向转染时应有的水平（并补偿胰酶消化后的贴壁损耗）：6孔板1.0-1.5×10⁶/孔，约为正向铺板密度的2倍，各容器接种量见表2。

⑵细胞重悬必须使用无双抗培养基，转染4-8h后换液时再加回双抗。

⑶复合物制备完成后应立即接种细胞，孔内放置不超过30分钟。

⑷不适用于神经元、原代肝细胞等极脆弱细胞——胰酶消化后再接种存活率不足。

3.不同培养容器反向转染完整用量（表2，HEK293T，核酸/试剂用量同正向）

培养容器	DNA量	Entranster^TM-H用量	稀释液（每路）	复合物总体积	接种细胞数	终培养体积
96-well	0.25μg	0.25μl	5μl	10μl	3-5×10⁴	100μl
48-well	0.5μg	0.5μl	10μl	20μl	6-10×10⁴	200μl
24-well	1μg	1μl	25μl	50μl	1.2-2×10⁵	500μl
12-well	2μg	2μl	25μl	50μl	2.5-4×10⁵	1ml
6-well/35-mm	5μg	5μl	50μl	100μl	1.0-1.5×10⁶	2ml
60mm/T25 flask	10μg	10μl	125μl	250μl	2-3×10⁶	5ml
100mm dish	25μg	25μl	500μl	1ml	6-8×10⁶	15ml

注：慢病毒包装等以产量最大化为目标的应用，反向接种密度可上调至接近满孔（6孔板2-3×10⁶/孔）。

注：反向转染时细胞处于刚贴壁起步阶段，对毒性较敏感。如出现细胞批量脱落或贴壁不良，按以下顺序排查：①试剂量下调20-30%（即降低试剂:DNA比例）；②细胞接种密度降10-20%；③转染前6-12h做血清饥饿预适应。

大规模悬浮转染（病毒包装与重组蛋白生产）

Entranster^TM-H可用于HEK293F、HEK293-6E、Expi293、HEK293T-suspension等悬浮细胞系的大规模转染，是慢病毒（LV）、腺相关病毒（AAV）、腺病毒（Ad）、重组抗体与重组蛋白生产的核心步骤，适合数十毫升到数十升级别的瞬时表达。

用量速查表（开始转染前先按培养体积查阅 DNA 与试剂用量）

培养体积	细胞密度	总DNA	Entranster^TM-H	复合物稀释液（每路）
30ml	2×10⁶/ml	30μg	22.5-30μl	3ml
100ml	2×10⁶/ml	100μg	75-100μl	10ml
250ml	2×10⁶/ml	250μg	190-250μl	25ml
500ml	2×10⁶/ml	500μg	375-500μl	50ml
1L	2×10⁶/ml	1mg	750μl-1ml	100ml
3L	2×10⁶/ml	3mg	2.25-3ml	300ml

注：3L 以上规模按表中比例线性放大（DNA 1μg/ml 培养、试剂 0.75-1.0μl/μg DNA、复合物体积 = 培养体积 × 20%）。

1.转染前细胞准备

细胞应处于对数生长期，存活率≥95%，传代次数30代以内。转染前一天按0.8-1.0×10⁶ cells/ml传代。转染当日细胞密度应达到1.8-2.2×10⁶ cells/ml，存活率≥95%。培养基使用对应细胞系的无血清悬浮培养基（如Freestyle 293、Expi293、F17、BalanCD HEK293、CDM4HEK293等；其中BalanCD HEK293性价比较高，性能接近Expi293/Freestyle expression medium而成本约低10倍）。不要使用PBS或含血清培养基稀释复合物。

2.复合物制备（以100ml培养体系为例）

⑴取100μg总质粒DNA加入10ml无血清稀释液（OPTI-MEM、150mM NaCl或5%葡萄糖），轻柔混匀。

⑵取75-100μl Entranster^TM-H（对应转染试剂(μl):DNA(μg)=0.75:1—1:1）加入另一支10ml无血清稀释液，混匀，室温静置5分钟。

⑶将试剂稀释液缓慢加入DNA稀释液中，吹吸或轻柔倒置混匀，室温静置15分钟（严禁超过20分钟）。

⑷将20ml复合物沿摇瓶壁缓慢滴加到100ml培养液，边加边轻摇摇瓶，使复合物快速分散。严禁整管倒入一处，否则易导致细胞批量死亡。

⑸摇瓶置于37℃、5-8% CO₂（按培养基厂家推荐）、120-135rpm摇床培养。

3.增效与补料

⑴转染4-6h后补加增效剂，按应用分类选择：①重组蛋白生产：VPA（终浓度2-4mM）或NaB（1-2mM）均可，可显著延缓细胞凋亡、提高产量30-100%；②AAV包装：首选VPA（10倍滴度提升），严禁使用NaB（抑制AAV衣壳装配）；③慢病毒包装：可选VPA（效果稳定），NaB个案差异较大。VPA经济性优于NaB（成本约为NaB的1/5）。

⑵转染24h后同步进行补料与温度切换：补加5-10%（v/v）补料培养基与3-6g/L葡萄糖；也可同步将温度由37℃降至32℃以延长产蛋白窗口期（对难表达蛋白尤其有效）。每24h监测一次葡萄糖与活率。

4.收获时间

应用	收获时间	收获形式
慢病毒（LV）	转染后48h与72h各收一次合并	上清，4℃ 500g/10min去细胞，0.45μm过滤
AAV（三质粒法）	72-96h	细胞与上清同时收获（AAV2多在细胞内，AAV9上清比例高）
腺病毒（Ad）	CPE出现50-80%时收	细胞收获
重组抗体与蛋白	96-144h（活率降至60-70%时）	上清

5.病毒包装质粒配比

⑴慢病毒（三质粒系统）：转移质粒：psPAX2：pMD2.G = 4:3:1（质量比）。

⑵AAV（三质粒系统）：pAAV-ITR-GOI：pAAV-RC（衣壳）：pHelper = 1:1:2（质量比）。

⑶腺病毒：按厂家系统说明，多数以转移质粒为主。

6.注意事项

⑴复合物总体积一般为培养体积的20%（DNA稀释液与试剂稀释液各占10%；如100ml培养→各10ml稀释液，合计20ml复合物）。体积过小易聚集，过大稀释转染试剂浓度。

⑵质粒必须为无内毒素级（<0.1EU/μg）。大规模转染对内毒素极敏感，>1EU/μg会显著抑制细胞生长。

⑶转染当日禁止补料和换液。

⑷首次放大建议先在30ml体系做试剂(μl):DNA(μg)比梯度（0.5:1、0.75:1、1:1，对应30μg DNA用15/22.5/30μl试剂）+ 收获时间梯度（48h/72h/96h），再放大到目标体积。

⑸质粒节约策略（可选）：可用salmon sperm DNA或非编码空载体作为填充DNA。推荐档：活性质粒占总DNA的20%，仍可达正常100%表达水平；极简档：活性质粒占总DNA的5-10%，可达约80%表达水平。两档均能显著降低大规模放大质粒成本。

常见问题与解决方案

问题	可能原因	解决方案
完全无表达（任意细胞均零信号）	阳性对照不足或质粒构建缺陷	用已知有效质粒（如pEGFP-N1）做阳性对照排查；检查启动子在该细胞系活性（CMV在原代细胞效率低）
完全无表达	DNA稀释液用了PBS或含血清培养基	必须用OPTI-MEM、150mM NaCl或5%葡萄糖
转染效率<10%	细胞代数过高或处于衰老期	改用20代以内的细胞；HEK293T长期培养易丢失T-抗原
转染效率<10%	质粒纯度不足	参考二节质粒纯度要求（OD260/280=1.8-2.0、OD260/230>2.0、内毒素<0.1EU/μg）
转染效率20-50%	试剂(μl):DNA(μg)比未达最优	做0.5:1/1:1/1.5:1三点梯度筛选；参考表1按容器对应比例；首次使用某细胞系，建议做3×3 DoE：试剂(μl):DNA(μg)比 (0.5:1/1:1/1.5:1) × 细胞密度 (贴壁50/65/80%汇合，或悬浮1.5/2.0/2.5×10⁶/ml)
转染效率20-50%	细胞密度未达推荐区间	贴壁转染密度调至60-80%；过低或过高均显著影响效率
转染后细胞批量脱落漂浮	试剂过量或双抗协同毒性	降至1:1(μl:μg)以下；转染当下及前4-6h使用无双抗培养基，4-8h换液时再加回双抗
转染后24-48h细胞缓慢凋亡	质粒含内毒素	改用Endo-Free级试剂盒提取；目标值<0.1EU/μg
排除以上仍有毒性	质粒表达产物本身具毒性	用pEGFP-N1等已知低毒质粒做对照，区分是试剂问题还是构建问题
复合物制备后出现絮状或沉淀	稀释液污染（PBS、血清、蛋白）	改用新鲜OPTI-MEM或150mM NaCl重做；DNA与试剂稀释液严禁含血清
复合物呈乳白色浑浊	孵育时间>25min或DNA浓度过高	缩短至15-20min；增大稀释体积降低DNA浓度
反向转染细胞结团或贴壁不均	加细胞后画圈摇板	改为前后或左右轻柔摇动；严禁画圈，否则细胞向孔中心聚集
反向转染效率显著低于正向	复合物在空孔内放置过久	复合物制备完成后30min内必须接种细胞；超过30min效率显著下降
反向转染毒性较大、细胞贴壁后批量死亡	细胞处于刚贴壁起步阶段、对试剂毒性更敏感	按顺序排查：先将试剂量下调20-30%，仍不改善再降接种密度10-20%，最后可于转染前6-12h血清饥饿预适应
大规模悬浮加料后批量死亡	复合物整管倒入一处导致局部过载	必须沿摇瓶壁缓慢边加边摇瓶；首次放大可将比例降至0.75:1(μl:μg)试做
蛋白产量偏低（100ml培养<5mg）	未做温度切换或未补VPA	转染24h后降温至32℃；同时补VPA 2-4mM或NaB 1-2mM；监测葡萄糖与活率（AAV 包装仅用 VPA，禁 NaB）
慢病毒滴度低（<10⁷ TU/ml）	三质粒配比不对或转移质粒过大	严格按转移质粒：psPAX2：pMD2.G=4:3:1；>10kb转移质粒提至5:3:1；72h二次收毒合并
AAV滴度低	收获过早或衣壳未完全装配	推迟至96h收获；细胞与上清同时收（AAV2主要在胞内，AAV9上清比例高）

运输与储存

常温运输，于4℃长期存储，有效期12个月。

安全性

本品使用安全，未发现任何生物、化学毒性。如不慎沾染，用清水冲洗即可。

质量保证

北京英格恩生物科技有限公司本产品实行严格质量检验，并进行转染验证，以确保产品质量。请用户使用前务必认真阅读操作手册。如用户仍然有问题，请立即联系本公司人员，英格恩公司将负责提供全程技术服务。

使用限制

本品仅限科研用途。

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