产品介绍
Entranster™-H 是英格恩生物研发的纳米聚合物转染试剂，针对 HEK293 全系优化，细胞毒性可控，覆盖从微孔板到数十升悬浮放大全场景。
本品适合在 HEK293 全系（HEK293、HEK293T、HEK293T-suspension、HEK293F、HEK293-6E、Expi293 等）细胞中进行贴壁转染、大规模悬浮转染、病毒包装（慢病毒、AAV、腺病毒）与重组蛋白生产。既支持贴壁培养也支持悬浮培养。
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Entranster™-H 是英格恩生物研发的纳米聚合物转染试剂，针对 HEK293 全系优化，细胞毒性可控，覆盖从微孔板到数十升悬浮放大全场景。
本品适合在 HEK293 全系（HEK293、HEK293T、HEK293T-suspension、HEK293F、HEK293-6E、Expi293 等）细胞中进行贴壁转染、大规模悬浮转染、病毒包装（慢病毒、AAV、腺病毒）与重组蛋白生产。既支持贴壁培养也支持悬浮培养。
本品适合在 HEK293 全系（HEK293、HEK293T、HEK293T-suspension、HEK293F、HEK293-6E、Expi293 等）细胞中进行贴壁转染、大规模悬浮转染、病毒包装（慢病毒、AAV、腺病毒）与重组蛋白生产。既支持贴壁培养也支持悬浮培养。
可用于大规模正向转染，也可用于高通量筛选的反向转染
可用于病毒包装，也可以用于重组蛋白转染
既支持贴壁培养也支持悬浮培养。
一、重要提示
二、实验过程（以 6 孔板为例）
1. 提前一天细胞铺板
提前一天将 HEK293 系细胞按 5-8×10⁵ cells/孔种植在 6 孔板（其他容器按表面积换算，参考下方用量表）；以转染时细胞密度在 60-80% 为宜。
2. 转染过程
⑴将 5μg 的 DNA 用 50μl 无血清稀释液稀释，充分混匀，制成 DNA 稀释液。
注意：无血清稀释液建议采用 OPTI-MEM 或无血清 DMEM。
⑵将 5μl 的 Entranster™-H 用 50μl 无血清稀释液稀释，充分混匀，制成 Entranster™-H 稀释液。室温静置 5 分钟。
⑶将 Entranster™-H 稀释液缓慢加入到 DNA 稀释液中，充分混匀（加样器吹吸 8-10 次或短暂涡旋 3-5 秒，避免长时间剧烈振荡），室温静置 15-20 分钟（不超过 25 分钟）。转染复合物制备完成。
⑷将转染复合物沿孔壁缓慢滴加到含细胞和完全培养基的培养容器中，前后或左右轻摇混匀（不可画圈）。
注意：①对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。②转染当下及转染前 4-6h 建议使用无双抗培养基（双抗存在协同毒性），转染后 4-8h 换液时可换回含双抗的完全培养基。
⑸继续培养 24-48 小时。如细胞出现漂浮、形态异常等毒性表现，可于转染后 4-8 小时更换为新鲜完全培养基（6-8h 换液毒性更低、批次重复性更好）；如细胞状态良好，可无需换液直接培养至检测时间点。
注意：如转染后需要用 Trizol 提取 RNA 等对培养液成分敏感的下游操作，无论细胞状态如何，均应在转染后 4-8h 严格更换为新鲜培养基。
三、不同细胞培养容器转染用量
| 细胞培养容器 | DNA 量 | DNA 稀释液体积 | Entranster™-H 用量 | Entranster™-H 稀释液体积 | 培养基总量 |
| 96-well | 0.25μg | 5μl | 0.25μl | 5μl | 100μl |
| 48-well | 0.5μg | 10μl | 0.5μl | 10μl | 200μl |
| 24-well | 1μg | 25μl | 1μl | 25μl | 500μl |
| 12-well | 2μg | 25μl | 2μl | 25μl | 1ml |
| 6-well/35-mm | 5μg | 50μl | 5μl | 50μl | 2ml |
| 60mm/T25 flask | 10μg | 125μl | 10μl | 125μl | 5ml |
| 100mm dish | 25μg | 500μl | 25μl | 500μl | 15ml |
注意：96-well/48-well 中试剂用量仅 0.25-0.5μl，普通微量加样器难以精确移液。建议按 8-12 倍量预混 Entranster™-H 稀释液（试剂+无血清培养基），再按孔数等量分装，可避免微体积移液误差。
注意：如同时共转染多种质粒，上表中的 DNA 量为所有质粒用量之和（各质粒按实验所需比例分配），转染试剂用量不变。
Sci Rep. 2025 Jul 1;15(1):20687.doi: 10.1038/s41598-025-05826-z. LncRNA CTD-2555A7.2 promotes bone formation with LncRNA-specific cascade amplification strategy LncRNA CTD-2555A7.2通过LncRNA特异性级联扩增策略促进骨形成 中文解读
反向转染指先在培养板内形成DNA-试剂复合物，再加入悬浮细胞悬液，使复合物与细胞同步沉降接触。适用于HEK293T高通量筛选、慢病毒包装快速流程，以及希望省去”提前一天铺板”的实验。
1.实验过程（以6孔板为例）
预备：操作前先用胰酶消化HEK293T细胞，DMEM+10%FBS（无双抗）重悬至5-8×10⁵ cells/ml，置37℃备用。与⑴-⑶复合物制备过程并行进行，避免复合物在空孔内放置超过30分钟。
⑴将5μg的DNA用50μl无血清稀释液（OPTI-MEM或无血清DMEM）稀释，充分混匀（用量同正向，参考本页「转染步骤与用量」的用量表按容器对应；如做慢病毒包装，5μg为三质粒总量，按转移质粒：psPAX2：pMD2.G=4:3:1分配，参考本页「大规模悬浮转染（病毒包装与重组蛋白生产）」的 5.病毒包装质粒配比）。
⑵将5μl的Entranster™-H用50μl无血清稀释液稀释，混匀，室温静置5分钟。
⑶将Entranster™-H稀释液缓慢加入到DNA稀释液中，充分混匀（加样器吹吸8-10次或短暂涡旋3-5秒，避免长时间剧烈振荡），室温静置15-20分钟（不超过25分钟）。转染复合物制备完成。
⑷将全部转染复合物（约100μl）均匀滴加入空培养孔，轻摇使其铺展于孔底。
⑸取预备好的细胞悬液（5-8×10⁵ cells/ml）约1.9ml加入到含复合物的孔中，终体积约2ml，对应每孔1.0-1.5×10⁶ cells。
⑹轻柔前后或左右摇动培养板（不可画圈，否则细胞会向中心聚集），放入培养箱培养。
⑺4-8h后细胞贴壁，可酌情换为新鲜完全培养基；用于慢病毒包装时换为2% FBS收毒培养基（低血清下病毒颗粒更稳定，便于后续浓缩）。常规检测时间同正向转染（24-48h）；慢病毒包装收毒时间按本页「大规模悬浮转染（病毒包装与重组蛋白生产）」的 4.收获时间。
2.注意事项
⑴反向转染细胞当天接种、当天转染，接种密度需直接达到正向转染时应有的水平（并补偿胰酶消化后的贴壁损耗）：6孔板1.0-1.5×10⁶/孔，约为正向铺板密度的2倍，各容器接种量见表2。
⑵细胞重悬必须使用无双抗培养基，转染4-8h后换液时再加回双抗。
⑶复合物制备完成后应立即接种细胞，孔内放置不超过30分钟。
⑷不适用于神经元、原代肝细胞等极脆弱细胞——胰酶消化后再接种存活率不足。
3.不同培养容器反向转染完整用量（表2，HEK293T，核酸/试剂用量同正向）
| 培养容器 | DNA量 | Entranster™-H用量 | 稀释液（每路） | 复合物总体积 | 接种细胞数 | 终培养体积 |
| 96-well | 0.25μg | 0.25μl | 5μl | 10μl | 3-5×10⁴ | 100μl |
| 48-well | 0.5μg | 0.5μl | 10μl | 20μl | 6-10×10⁴ | 200μl |
| 24-well | 1μg | 1μl | 25μl | 50μl | 1.2-2×10⁵ | 500μl |
| 12-well | 2μg | 2μl | 25μl | 50μl | 2.5-4×10⁵ | 1ml |
| 6-well/35-mm | 5μg | 5μl | 50μl | 100μl | 1.0-1.5×10⁶ | 2ml |
| 60mm/T25 flask | 10μg | 10μl | 125μl | 250μl | 2-3×10⁶ | 5ml |
| 100mm dish | 25μg | 25μl | 500μl | 1ml | 6-8×10⁶ | 15ml |
注：慢病毒包装等以产量最大化为目标的应用，反向接种密度可上调至接近满孔（6孔板2-3×10⁶/孔）。
注：反向转染时细胞处于刚贴壁起步阶段，对毒性较敏感。如出现细胞批量脱落或贴壁不良，按以下顺序排查：①试剂量下调20-30%（即降低试剂:DNA比例）；②细胞接种密度降10-20%；③转染前6-12h做血清饥饿预适应。
Entranster™-H可用于HEK293F、HEK293-6E、Expi293、HEK293T-suspension等悬浮细胞系的大规模转染，是慢病毒（LV）、腺相关病毒（AAV）、腺病毒（Ad）、重组抗体与重组蛋白生产的核心步骤，适合数十毫升到数十升级别的瞬时表达。
用量速查表（开始转染前先按培养体积查阅 DNA 与试剂用量）
| 培养体积 | 细胞密度 | 总DNA | Entranster™-H | 复合物稀释液（每路） |
| 30ml | 2×10⁶/ml | 30μg | 22.5-30μl | 3ml |
| 100ml | 2×10⁶/ml | 100μg | 75-100μl | 10ml |
| 250ml | 2×10⁶/ml | 250μg | 190-250μl | 25ml |
| 500ml | 2×10⁶/ml | 500μg | 375-500μl | 50ml |
| 1L | 2×10⁶/ml | 1mg | 750μl-1ml | 100ml |
| 3L | 2×10⁶/ml | 3mg | 2.25-3ml | 300ml |
注：3L 以上规模按表中比例线性放大（DNA 1μg/ml 培养、试剂 0.75-1.0μl/μg DNA、复合物体积 = 培养体积 × 20%）。
1.转染前细胞准备
细胞应处于对数生长期，存活率≥95%，传代次数30代以内。转染前一天按0.8-1.0×10⁶ cells/ml传代。转染当日细胞密度应达到1.8-2.2×10⁶ cells/ml，存活率≥95%。培养基使用对应细胞系的无血清悬浮培养基（如Freestyle 293、Expi293、F17、BalanCD HEK293、CDM4HEK293等；其中BalanCD HEK293性价比较高，性能接近Expi293/Freestyle expression medium而成本约低10倍）。不要使用PBS或含血清培养基稀释复合物。
2.复合物制备（以100ml培养体系为例）
⑴取100μg总质粒DNA加入10ml无血清稀释液（OPTI-MEM、150mM NaCl或5%葡萄糖），轻柔混匀。
⑵取75-100μl Entranster™-H（对应转染试剂(μl):DNA(μg)=0.75:1—1:1）加入另一支10ml无血清稀释液，混匀，室温静置5分钟。
⑶将试剂稀释液缓慢加入DNA稀释液中，吹吸或轻柔倒置混匀，室温静置15分钟（严禁超过20分钟）。
⑷将20ml复合物沿摇瓶壁缓慢滴加到100ml培养液，边加边轻摇摇瓶，使复合物快速分散。严禁整管倒入一处，否则易导致细胞批量死亡。
⑸摇瓶置于37℃、5-8% CO₂（按培养基厂家推荐）、120-135rpm摇床培养。
3.增效与补料
⑴转染4-6h后补加增效剂，按应用分类选择：①重组蛋白生产：VPA（终浓度2-4mM）或NaB（1-2mM）均可，可显著延缓细胞凋亡、提高产量30-100%；②AAV包装：首选VPA（10倍滴度提升），严禁使用NaB（抑制AAV衣壳装配）；③慢病毒包装：可选VPA（效果稳定），NaB个案差异较大。VPA经济性优于NaB（成本约为NaB的1/5）。
⑵转染24h后同步进行补料与温度切换：补加5-10%（v/v）补料培养基与3-6g/L葡萄糖；也可同步将温度由37℃降至32℃以延长产蛋白窗口期（对难表达蛋白尤其有效）。每24h监测一次葡萄糖与活率。
4.收获时间
| 应用 | 收获时间 | 收获形式 |
| 慢病毒（LV） | 转染后48h与72h各收一次合并 | 上清，4℃ 500g/10min去细胞，0.45μm过滤 |
| AAV（三质粒法） | 72-96h | 细胞与上清同时收获（AAV2多在细胞内，AAV9上清比例高） |
| 腺病毒（Ad） | CPE出现50-80%时收 | 细胞收获 |
| 重组抗体与蛋白 | 96-144h（活率降至60-70%时） | 上清 |
5.病毒包装质粒配比
⑴慢病毒（三质粒系统）：转移质粒：psPAX2：pMD2.G = 4:3:1（质量比）。
⑵AAV（三质粒系统）：pAAV-ITR-GOI：pAAV-RC（衣壳）：pHelper = 1:1:2（质量比）。
⑶腺病毒：按厂家系统说明，多数以转移质粒为主。
6.注意事项
⑴复合物总体积一般为培养体积的20%（DNA稀释液与试剂稀释液各占10%；如100ml培养→各10ml稀释液，合计20ml复合物）。体积过小易聚集，过大稀释转染试剂浓度。
⑵质粒必须为无内毒素级（<0.1EU/μg）。大规模转染对内毒素极敏感，>1EU/μg会显著抑制细胞生长。
⑶转染当日禁止补料和换液。
⑷首次放大建议先在30ml体系做试剂(μl):DNA(μg)比梯度（0.5:1、0.75:1、1:1，对应30μg DNA用15/22.5/30μl试剂）+ 收获时间梯度（48h/72h/96h），再放大到目标体积。
⑸质粒节约策略（可选）：可用salmon sperm DNA或非编码空载体作为填充DNA。推荐档：活性质粒占总DNA的20%，仍可达正常100%表达水平；极简档：活性质粒占总DNA的5-10%，可达约80%表达水平。两档均能显著降低大规模放大质粒成本。
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
| 完全无表达（任意细胞均零信号） | 阳性对照不足或质粒构建缺陷 | 用已知有效质粒（如pEGFP-N1）做阳性对照排查；检查启动子在该细胞系活性（CMV在原代细胞效率低） |
| 完全无表达 | DNA稀释液用了PBS或含血清培养基 | 必须用OPTI-MEM、150mM NaCl或5%葡萄糖 |
| 转染效率<10% | 细胞代数过高或处于衰老期 | 改用20代以内的细胞；HEK293T长期培养易丢失T-抗原 |
| 质粒纯度不足 | 参考本页「转染步骤与用量」的质粒纯度要求（OD260/280=1.8-2.0、OD260/230>2.0、内毒素<0.1EU/μg） | |
| 转染效率20-50% | 试剂(μl):DNA(μg)比未达最优 | 做0.5:1/1:1/1.5:1三点梯度筛选；参考本页「转染步骤与用量」的用量表按容器对应比例；首次使用某细胞系，建议做3×3 DoE：试剂(μl):DNA(μg)比 (0.5:1/1:1/1.5:1) × 细胞密度 (贴壁50/65/80%汇合，或悬浮1.5/2.0/2.5×10⁶/ml) |
| 细胞密度未达推荐区间 | 贴壁转染密度调至60-80%；过低或过高均显著影响效率 | |
| 转染后细胞批量脱落漂浮 | 试剂过量或双抗协同毒性 | 降至1:1(μl:μg)以下；转染当下及前4-6h使用无双抗培养基，4-8h换液时再加回双抗 |
| 转染后24-48h细胞缓慢凋亡 | 质粒含内毒素 | 改用Endo-Free级试剂盒提取；目标值<0.1EU/μg |
| 排除以上仍有毒性 | 质粒表达产物本身具毒性 | 用pEGFP-N1等已知低毒质粒做对照，区分是试剂问题还是构建问题 |
| 复合物制备后出现絮状或沉淀 | 稀释液污染（PBS、血清、蛋白） | 改用新鲜OPTI-MEM或150mM NaCl重做；DNA与试剂稀释液严禁含血清 |
| 复合物呈乳白色浑浊 | 孵育时间>25min或DNA浓度过高 | 缩短至15-20min；增大稀释体积降低DNA浓度 |
| 反向转染细胞结团或贴壁不均 | 加细胞后画圈摇板 | 改为前后或左右轻柔摇动；严禁画圈，否则细胞向孔中心聚集 |
| 反向转染效率显著低于正向 | 复合物在空孔内放置过久 | 复合物制备完成后30min内必须接种细胞；超过30min效率显著下降 |
| 反向转染毒性较大、细胞贴壁后批量死亡 | 细胞处于刚贴壁起步阶段、对试剂毒性更敏感 | 按顺序排查：先将试剂量下调20-30%，仍不改善再降接种密度10-20%，最后可于转染前6-12h血清饥饿预适应 |
| 大规模悬浮加料后批量死亡 | 复合物整管倒入一处导致局部过载 | 必须沿摇瓶壁缓慢边加边摇瓶；首次放大可将比例降至0.75:1(μl:μg)试做 |
| 蛋白产量偏低（100ml培养<5mg） | 未做温度切换或未补VPA | 转染24h后降温至32℃；同时补VPA 2-4mM或NaB 1-2mM；监测葡萄糖与活率（AAV 包装仅用 VPA，禁 NaB） |
| 慢病毒滴度低（<10⁷ TU/ml） | 三质粒配比不对或转移质粒过大 | 严格按转移质粒：psPAX2：pMD2.G=4:3:1；>10kb转移质粒提至5:3:1；72h二次收毒合并 |
| AAV滴度低 | 收获过早或衣壳未完全装配 | 推迟至96h收获；细胞与上清同时收（AAV2主要在胞内，AAV9上清比例高） |
常温运输，于4℃长期存储，有效期12个月。
本品使用安全，未发现任何生物、化学毒性。如不慎沾染，用清水冲洗即可。
北京英格恩生物科技有限公司对本产品实行严格质量检验，并进行转染验证，以确保产品质量。请用户使用前务必认真阅读操作手册。如用户仍然有问题，请立即联系本公司人员，英格恩公司将负责提供全程技术服务。
本品仅限科研用途。
293 全系转染试剂 Entranster™-H 适用于哪些细胞和用途？
针对 HEK293 全系（HEK293、HEK293T、HEK293T-suspension、HEK293F、HEK293-6E、Expi293 等）优化，适合贴壁转染、大规模悬浮转染、病毒包装与重组蛋白生产。
Entranster™-H 支持哪些病毒包装？
可用于慢病毒、AAV、腺病毒等病毒包装，同时适用于重组蛋白生产。
Entranster™-H 既能贴壁又能悬浮吗？支持多大规模？
既支持贴壁培养也支持悬浮培养，覆盖从微孔板到数十升悬浮放大的全场景；既可用于大规模正向转染，也可用于高通量筛选的反向转染。
Entranster™-H 如何运输储存？有效期多久？
常温运输，到货后于 4℃ 避光长期存储，有效期 12 个月。
Entranster™-H 有哪些规格和货号？
规格为 0.4ml，货号 18668-04。
293 全系 H 和普通转染试剂怎么选？
按实验需求选：HEK293 全系转染、病毒包装（慢病毒、AAV、腺病毒）和重组蛋白生产用 293 全系 Entranster™-H；质粒 DNA 和长片段（>1kb）mRNA 用 Entranster™-H4000;siRNA、miRNA 等 1kb 以下的小 RNA 用 Entranster™-R4000；神经元、原代细胞等难转染细胞用电穿孔缓冲液 Entranster™-E；动物体内转染用 DNA 或 RNA 体内转染试剂 Entranster™-in vivo。更多见官网「转染试剂选型指南」。
Entranster™-H 做 AAV 包装，三个质粒的比例是多少？
AAV 三质粒系统：pAAV-ITR-GOI : pAAV-RC（衣壳）: pHelper = 1:1:2（质量比）。
慢病毒三质粒系统：转移质粒 : psPAX2 : pMD2.G = 4:3:1（质量比）。
腺病毒按所用系统的厂家说明，多数以转移质粒为主。
Entranster™-H 包装病毒，什么时候收获？
慢病毒（LV）：转染后 48h 与 72h 各收一次合并，取上清，4℃ 500g 离心 10 分钟去细胞，再经 0.45μm 过滤。
腺相关病毒（AAV，三质粒法）：72-96h，细胞与上清同时收获（AAV2 多在细胞内，AAV9 上清比例高）。
腺病毒（Ad）：CPE 出现 50-80% 时收，收细胞。
重组抗体与重组蛋白：96-144h（活率降至 60-70% 时）收上清。
Entranster™-H 大规模悬浮转染，各培养体积用多少 DNA 和试剂？
按培养体积查，细胞密度均为 2×10⁶/ml：
培养 30ml：总 DNA 30μg，Entranster™-H 22.5-30μl，复合物稀释液每路 3ml。
培养 100ml：总 DNA 100μg，Entranster™-H 75-100μl，复合物稀释液每路 10ml。
培养 250ml：总 DNA 250μg，Entranster™-H 190-250μl，复合物稀释液每路 25ml。
培养 500ml：总 DNA 500μg，Entranster™-H 375-500μl，复合物稀释液每路 50ml。
培养 1L：总 DNA 1mg，Entranster™-H 750μl-1ml，复合物稀释液每路 100ml。
培养 3L：总 DNA 3mg，Entranster™-H 2.25-3ml，复合物稀释液每路 300ml。
3L 以上按表中比例线性放大：DNA 1μg/ml 培养、试剂 0.75-1.0μl/μg DNA、复合物体积为培养体积的 20%。
适用 HEK293F、HEK293-6E、Expi293、HEK293T-suspension 等悬浮细胞系，适合数十毫升到数十升级别的瞬时表达。
Entranster™-H 大规模转染，复合物体积和质粒质量有什么要求？
复合物总体积一般为培养体积的 20%，DNA 稀释液与试剂稀释液各占 10%（如 100ml 培养对应各 10ml 稀释液、合计 20ml 复合物）。体积过小易聚集，过大会稀释转染试剂浓度。
质粒必须为无内毒素级（<0.1EU/μg）。大规模转染对内毒素极敏感，>1EU/μg 会显著抑制细胞生长。
转染当日禁止补料和换液。
Entranster™-H 首次放大，试剂和 DNA 的比例怎么定？
建议先在 30ml 体系做试剂(μl):DNA(μg) 比梯度 0.5:1、0.75:1、1:1，对应 30μg DNA 分别用 15μl、22.5μl、30μl 试剂；同时做收获时间梯度 48h、72h、96h，再放大到目标体积。
Entranster™-H 大规模悬浮转染，细胞要准备到什么状态？
细胞应处于对数生长期，存活率 ≥95%，传代次数 30 代以内。转染前一天按 0.8-1.0×10⁶ cells/ml 传代；转染当日密度应达 1.8-2.2×10⁶ cells/ml、存活率 ≥95%。
培养基使用对应细胞系的无血清悬浮培养基，如 Freestyle 293、Expi293、F17、BalanCD HEK293、CDM4HEK293。不要使用 PBS 或含血清培养基稀释复合物。
Entranster™-H 100ml 培养体系怎么配转染复合物？
1）取 100μg 总质粒 DNA 加入 10ml 无血清稀释液（OPTI-MEM、150mM NaCl 或 5% 葡萄糖），轻柔混匀。
2）取 75-100μl Entranster™-H（对应试剂μl : DNAμg = 0.75:1 至 1:1）加入另一支 10ml 无血清稀释液，混匀，室温静置 5 分钟。
3）将试剂稀释液缓慢加入 DNA 稀释液中（注意顺序，是转染试剂加入核酸，不是相反），吹吸或轻柔倒置混匀，室温静置 15 分钟，严禁超过 20 分钟。
4）将 20ml 复合物沿摇瓶壁缓慢滴加到 100ml 培养液，边加边轻摇摇瓶。
Entranster™-H 大规模转染怎么降低质粒成本？
可用 salmon sperm DNA 或非编码空载体作为填充 DNA。
推荐档：活性质粒占总 DNA 的 20%，仍可达正常 100% 表达水平。
极简档：活性质粒占总 DNA 的 5-10%，可达约 80% 表达水平。
Entranster™-H 做反向转染，各培养容器用量是多少？
以 HEK293T 为例，核酸与试剂用量同正向转染：
96 孔板：DNA 0.25μg + 稀释液 5μl，试剂 0.25μl + 稀释液 5μl，复合物总体积 10μl，接种 3-5×10⁴ 细胞，终体积 100μl。
48 孔板：DNA 0.5μg + 稀释液 10μl，试剂 0.5μl + 稀释液 10μl，复合物 20μl，接种 6-10×10⁴，终体积 200μl。
24 孔板：DNA 1μg + 稀释液 25μl，试剂 1μl + 稀释液 25μl，复合物 50μl，接种 1.2-2×10⁵，终体积 500μl。
12 孔板：DNA 2μg + 稀释液 25μl，试剂 2μl + 稀释液 25μl，复合物 50μl，接种 2.5-4×10⁵，终体积 1ml。
6 孔板/35mm：DNA 5μg + 稀释液 50μl，试剂 5μl + 稀释液 50μl，复合物 100μl，接种 1.0-1.5×10⁶，终体积 2ml。
60mm/T25：DNA 10μg + 稀释液 125μl，试剂 10μl + 稀释液 125μl，复合物 250μl，接种 2-3×10⁶，终体积 5ml。
100mm 皿：DNA 25μg + 稀释液 500μl，试剂 25μl + 稀释液 500μl，复合物 1ml，接种 6-8×10⁶，终体积 15ml。
慢病毒包装等以产量最大化为目标的应用，反向接种密度可上调至接近满孔（6 孔板 2-3×10⁶/孔）。
Entranster™-H 反向转染要注意什么？
1）当天接种、当天转染，接种密度需直接达到正向转染应有的水平，并补偿胰酶消化后的贴壁损耗：6 孔板 1.0-1.5×10⁶/孔，约为正向铺板密度的 2 倍。
2）细胞重悬必须使用无双抗培养基，转染 4-8 小时后换液时再加回双抗。
3）复合物制备完成后应立即接种细胞，孔内放置不超过 30 分钟。
4）不适用于神经元、原代肝细胞等极脆弱细胞，胰酶消化后再接种存活率不足。
5）加细胞后前后或左右轻柔摇动培养板，不可画圈，否则细胞会向孔中心聚集。
6）4-8 小时后细胞贴壁，可酌情换为新鲜完全培养基；用于慢病毒包装时换为 2% FBS 收毒培养基，低血清下病毒颗粒更稳定，便于后续浓缩。
Entranster™-H 反向转染出现细胞批量脱落或贴壁不良怎么排查？
反向转染时细胞处于刚贴壁起步阶段，对毒性较敏感。按以下顺序排查：
1）试剂量下调 20-30%，即降低试剂:DNA 比例；
2）细胞接种密度降 10-20%；
3）转染前 6-12 小时做血清饥饿预适应。
